纳米孔传感器可以检测通过纳米孔的离子电流变化，实现单分子灵敏度，已成功用于检测生物标志物，包括核酸、蛋白质和小分子。但在对超低浓度（亚皮摩尔）分子进行定量分析时，面临响应时间长的问题，因为分析物扩散到纳米孔的时间常数与分子必须扩散的距离成平方。同时，在复杂的样品中，如生物体液，样品中通过纳米孔传感器易位的其他物质也会在离子电流中表现出电阻脉冲，这意味着临床样品的选择性可能是一个挑战。

为了克服这些挑战，来自于澳大利亚新南威尔士大学的研究人员提出了一种光学纳米孔阻断传感器方法，能够快速检测超低浓度的物质。

研究人员使用的模型分析药物是血管内皮生长因子（VEGF），将荧光聚苯乙烯纳米颗粒（PSNPs）用抗VEGF抗体修饰，形成Ab-PSNPs，而纳米孔阵列的表面用抗VEGF适配体修饰，形成适配体纳米孔，通过在纳米孔上施加电场，将Ab-PSNP带到适配体纳米孔中。通过计算纳米孔阵列（676个纳米孔）中阻断与解阻事件的比率，量化亚皮摩尔浓度下的VEGF量。

研究人员没有通过离子电流的变化来确定阻断事件，而是利用荧光纳米颗粒和宽视场显微镜作为读出机制，从而实现可同时监测数百个纳米孔，显著增加了可检测到的阻断事件的数量，使纳米孔阻断传感器实现定量。

首先，研究人员在没有任何表面修饰的情况下，用裸露的纳米孔测量裸露的PSNP的封闭事件。当不施加电压时，没有荧光信号；当向反式室施加1.5 V的电压时，观察到许多荧光信号，证明通过电场可以将纳米颗粒驱动进入纳米孔。

为了增强纳米孔表面的抗污染性能，以减少非特异性结合，研究人员研究了纳米孔表面化学功能化，以及非特异性颗粒从不同直径纳米孔中移除的去除效率。实验成功地展示了通过电场控制可以区分特异性和非特异性结合的事件，且通过选择合适的纳米孔直径和电场条件，可以有效地移除非特异性结合的纳米颗粒，提高了传感器的选择性和准确性。

接下来，研究人员展示了根据可以从孔隙中去除的颗粒数量（非特异性事件）和施加负电压时留在孔中的颗粒数量（特定事件）来检测目标蛋白质VEGF的能力。实验结果表明，利用光学纳米孔阻断传感器可以成功区分特异性和非特异性事件，通过计算施加负电压后留在孔中的颗粒百分比，可以定量分析VEGF的浓度。

最后，研究人员使用不同浓度的VEGF与固定浓度的Ab-PSNP进行定量检测实验，所用VEGF浓度从0到7.895 pM，在不同浓度下，Ab-PSNP与VEGF的结合比率如下图所示。同时，实验能够检测的最低VEGF浓度为78.75 fM（3 pg/mL）。

总之，研究人员展示了一种在高密度纳米孔阵列（676个纳米孔）中独立监测荧光纳米颗粒阻断/解阻事件的技术，可用于使用单分子计数来定量分析超低浓度的分析物，并证明了其在亚皮摩尔范围内定量蛋白质VEGF的能力。

未来，该技术可能扩展到其他在生物样本中以超低浓度存在的分析物的检测，通过增加检测的纳米孔数量，可以提高检测的灵敏度。

来源：传感器专家网